Главная


segherie.ru

Реакция связывания комплемента тромбоцитами. Постановка опыта

Сенсибилизация эритроцитов барана.

ЭБ 3—4 раза отмывают 0,15 М NaCl, последнюю отмывку делают барбиталовым буфером. Из осадка готовят суспензию ЭБ в том же буфере (4х106 клеток/мкл). Для сенсибилизации к суспензии эритроцитов медленно добавляют равный объем гемолизина, титр которого подбирают в предварительном опыте. Смесь инкубируют 30 минут на водяной бане при 37°С, многократно ее перемешивая, затем охлаждают до 4°С. Сенсибилизированные эритроциты готовят в день опыта.

Определение титра гемолизина. Готовят разведения гемолитической сыворотки от 1:400 до 1/12 800 с двукратным шагом, по 2 мл каждого разведения. К 2 мл каждого разведения гемолизина приливают равный объем суспензии ЭБ (4х106 клеток/мкл), происходит сенсибилизация. Реакцию ставят в камере для микротитрования под слоем вазелинового масла. Комплемент добавляют в избытке (сыворотку АВ в разведении 1 : 10 или сыворотку морской свинки в разведении 1 : 20).

Наибольшее разведение гемолизина, при котором еще наблюдается полный гемолиз, содержит 1 гемолитическую единицу. Для постановки основного опыта используют 4 гемолитические единицы.

Пример: если полный гемолиз наблюдается при разведении гемолизина 1:3200, то для опыта используют разведение 1 :800.

При повседневном проведении реакции связывания комплемента с одними и теми же реагентами титр гемолизина определяют 1 раз в неделю. Если титр комплемента известен, можно провести перекрестное титрование гемолизина. В приведенную таблице схему титрования вводят разведения комплемента, указанные ниже.

Схема титрования гемолизина

Схема титрования гемолизина

Определение титра комплемента. Все разведения комплемента готовят на барбиталовом буфере. Вспомогательное титрование и основной опыт проводят в одинаковых условиях. Титр комплемента определяют каждый раз в день постановки опыта. Чтобы повысить чувствительность реакции связывания комплемента, приготовляют следующие разведения комплемента: 1: б, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28, 32. Камеру для титрования заполняют 6—8 мл вазелинового масла. Все пробы дублируют.

Схема титрования комплемента

Схема титрования комплемента

Результаты реакции легче учитывать после осаждения эритроцитов центрифугированием. Степень гемолиза оценивают визуально по окраске надосадочной фракции и величине осадка эритроцитов в баллах от 0 до 4.

Оценка степени гемолиза

Оценка степени гемолиза

Наибольшее разведение комплемента, которое еще дает полный гемолиз, принимают за 1 гемолитическую единицу комплемента. В основном опыте используют 2 единицы комплемента. Если, например, комплемент в разведении 1 : 24 вызывает полный гемолиз ЭБ, для основного опыта используют разведение 1 :12. При использовании одной гемолитической единицы чувствительность реакции связывания комплемента возрастает, но возрастает также влияние помех.

Международная стандартизированная методика реакций связывания комплемента для определения HLA-антигенов на тромбоцитах. Заливают камеры для титрования 6—8 мл вазелинового масла. В лунки вносят по 2 мкл следующих реагентов:

Антитела (сыворотка в различных разведениях, элюаты).
Антиген (суспензия тромбоцитов 0,5х106 клеток/мкл).
Комплемент (сыворотка АВ 1 ЕД/мкл).
Смешивают, инкубируют 60 минут при 37°С.
Сенсибилизированные ЭБ (2х106 клеток/мкл).
Смешивают, инкубируют 30 минут при 37°С.
Центрифугируют, учитывают результаты реакции.

Для каждой серии суспензии тромбоцитов и для каждой сыворотки ставят следующие контроли:

Контроль антигена:
барбиталовый буфер 2 мкл
суспензия тромбоцитов 2 мкл
комплемент 2 мкл
суспензия сенсибилизированных ЭБ 2 мкл

Контроль антител:
сыворотка 2 мкл
барбиталовый буфер 2 мкл
комплемент 2 мкл
суспензия сенсибилизированных ЭБ 2 мкл

Если нет подходящей центрифуги, микропланшеты оставляют на 30 минут при комнатной температуре или 4°С для полного осаждения негемолизированных эритроцитов. Учет реакции проводят, как и при титровании комплемента, в баллах. В крупных лабораториях проводят количественную реакцию связывания комплемента на автоматическом микроскопе-денситометре. Причинами ложноположительных или ложноотрицательных результатов могут быть:

— загрязнение центрифужных пробирок, микропланшетов, пипеток, шприцев и т. д.;
— нежелательные примеси в сыворотках, суспензиях тромбоцитов или растворах;
— контаминация сывороток, суспензий тромбоцитов и растворов бактериями или грибами;
— неправильное хранение сыворотки, приводящее и ингибнрованию комплемента;
— подавление цитратом и другими антикоагулянтами активности комплемента. В связи с этим необходимо тщательно отмывать клетки от антикоагулянтов. Сыворотки, полученные методом плазмафереза, также ингибируют комплемент;
— потеря некоторыми препаратами тромбоцитов антигенностп при хранении свыше 4 мес при 4°С;
— изоагглютинины анти-А и анти-В, присутствующие в исследуемой сыворотке, могут вызывать ложноположительную реакцию, если суспензия тромбоцитов содержит большую примесь эритроцитов, которые связывают комплемент;
— суспензия тромбоцитов может быть использована не ранее, чем через сутки после ее получения, в противном случае наблюдается отрицательная реакция.