Главная


На сайте montale-original.ru ароматы монталь.

Реакция связывания комплемента. Постановка опыта

Материалы и оборудование

Реагенты

Вероналовый буфер:
NaCl - 85,0 г
Диэтилбарбитуровая кислота - 5,75 г
Диэтилбарбитурат натрия - 3,76 г
MgCl2-6H20 - 1,68 г
СаС12 (безводный) - 0,28 г
Дистиллированная вода - до 2000,0 мл
рН

Раствор Витте для консервации комплемента:
Сульфат калия - 10,0 г
Борная кислота - 4,0 г
Дистиллированная вода - 100,0 мл
Раствор автоклавируют в течение 1 ч.

Раствор Олсвера:
Глюкоза - 24,6 г
Нитрат натрия - 9,6 г
Хлорид натрия - 5,04 г
Дистиллированная вода - 1200 мл

Эритроциты: отбирают в стерильных условиях кровь в раствор в соотношении 1+2. Разливают смесь по стерильным пробиркам. Перед употреблением выдерживают смесь 2 дня. Сохранность — 6—8 нед.

Гемолизин: используют амбоцепторы государственного института иммунопрепаратов в Берлине. Амбоцепторы не должны агглютинировать эритроциты. Разведения свыше 1:1200 не используются.

Комплемент: используют свежие лиофилизированные или консервированные сыворотки (валовую сыворотку, взятую от возможно большего числа животных). Кровь для сывороток получают пункцией сердца или вскрытием сонной артерии с целью предотвращения бактериального загрязнения. Поскольку не всегда имеются коммерческие препараты комплемента, можно использовать комплемент, консервированный раствором Витте. Активность таких препаратов сохраняется при 5°С в течение б месяцев. В любом случае препарат комплемента не должен быть загрязнен специфическими антителами, сыворотки, содержащие менее 50 ЕД активности в мл, для работы не пригодны.

Антигены: для диагностики рекомендуется использовать официально стандартизованные препараты, но и в этом случае желательно точно установить, кривые изофиксации.

Оснащение:

Фотометр (например, Carl Ziss, Иена); микропланшеты для титрования (U-образная форма лунок), микрошприцы на 25 мкл, устройство для отмывки планшет, автоматизированная микросистема для титрования (для реакции связывания комплемента в 0,2 мл), стеклянные пробирки и штативы, термостат на 37°С, водяная баня для инактивации комплемента (56°С), холодильник, центрифугу.

Гемолитическая система

Получение суспензии эритроцитов барана

Законсервированные эритроциты барана трижды отмывают буфером. Получают 3% суспензию. 0,5 мл этой суспензии смешивают с 4,5 мл дистиллированной воды, определяют экстинк-цию при длине волны 540 нм в односантиметровом кювете. Получают 1,5% суспензию:

V — наличный объем, Е — измеренная экстииция

Проверка гемолизинов (амбоцептора)

1 часть = 25 мкл (микропроба) или 200 мкл (макро = РСК)

Определение титра агглютинации: (исключительно при холодовом связывании):

Состав реакционной смеси:

1 часть амбоцептора (начиная с 1 :30, f = 2)
1 часть 1,5% суспензии эритроцитов
Инкубация 18 часов при 5°С
Визуальный учет

Определение необходимого разведения гемолизина:

Состав реакционной смеси:

1 часть амбоцептора
1 часть 1,5% суспензии эритроцитов
2 части буфера
1 часть комплемента 1 : 30
Инкубация 45 мин при 37°С
Определяют 4—5-кратный титр 100% гемолиза

Определение авидности:

Состав реакционной смеси:

2 ряда разведений
1 часть комплемента (начиная с 1 : 37,5; f = 1,25)
2 части буфера
2 части гемолитической системы (1 часть 1% суспензии эритроцитов + 1 часть рабочего разведения гемолизина)
Инкубация 15 минут и соответственно 45 минут при 37°С определяют титр 95% гемолиза (ТГ)

Степень авидности должна быть по возможности не выше 0,9 и не ниже 0,7. Гемолизин и эритроциты в день эксперимента смешивают в равных объемах и сохраняют при 5°С, перед использованием прогревают в течение 30 минут при 37°С на водяной бане.

Ряды разведений

f = 2: пример: 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 :80 и т. д.
f = 1,25: пример: 1:10, 1:1,25, 1:15,7; 1:19,6, 1:24,5 и т. д.

Приготовление антигена

Часто в практике научных исследований приходится пользоваться нестандартизованными антигенами. Эти антигены следует как можно тщательнее очистить от сопутствующих примесей, способных привести к ложноположительным результатам. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить дифференциацию между комплементингибирующим и специфическим антигенным действием. Для этой цели предназначен контроль 2. Для постановки контроля 1 необходимы тщательно охарактеризованные реагенты (антигены, сыворотки и т. д.). Учитывая желательную точность результатов, оценки антигенов проводят макрометодом. Во всех случаях необходимо не только использовать оптимальные дозы АГ, но также контролировать его специфичность.

Контроль 1 (предварительный опыт)

Состав реакционной смеси:

1 часть АГ (начиная с разведения 1 :8, f = 2)
1 часть АС (начиная с 1 : 10, f = 2)
1 часть комплемента (2 ЕД активности; разведение 1:25 или 1 :20)
Инкубация 18 ч при 5°С, затем 10 мин при 37 °С.
2 части гемолитической системы
Наблюдение за полнотой гемолиза в контрольной пробирке

Для этого эксперимента используют титрование по схеме так называемой шахматной доски или блок-титрование, в котором анализируют ряд разведений АГ относительно ряда разведений антисыворотки. Степень торможения гемолиза оценивается ио четырехбалльной системе. В качестве единицы АГ берут такое его максимальное разведение, которое способно связывать 3—4 максимальных разведения сыворотки. Исследуемый и контрольный антигены, контрольная антисыворотка не должны давать торможения гемолиза. В основном опыте используют 2 единицы антигена.

Контроль 2 (предварительный опыт)

Определение комплементингибирующего действия (в пробирках)

Состав реакционной смеси:

0,2 мл комплемента (начиная с разведения 1:37,5; f — 1,25)
0,2 мл антигена (начиная с разведения 1:8, f=2)
0,2 мл буфера
Инкубация 18 часов при 5 °С
0,4 мл гемолитической системы
Инкубация 45 минут при 37 °С
Фотометрическое определение 95% ТГ
Расчет фактора потребления комплемента для каждого разведения АГ

Определение комплементингибирующего действия АГ

Определение комплементингибирующего действия АГ

К — контрольное значение гемолиза

Необходимо проверять наличие неспецифического комплементингибирующего действия. В целом оно должно проявляться не более чем в 1—2 разведениях (при шаге = 1,25) по сравнению с контролем.

Расчет фактора потребления комплемента (ФПК). ФПК определяют для каждого разведения АГ по формуле:

для разведения сыворотки 1:5—1:20   К=3,0
для разведения сыворотки начиная с 1 :40 К=2,5

Для определения ФПК ставят контроль 2, так как значение ФПК необходимо знать для многих диагностически важных АГ в предварительной оценке комплемента. Это можно пояснить примером на рисунке.

Определения фактора потребления комплемента

Определения фактора потребления комплемента


KoF: для К (2,5) =3,0;
KoF: для К (3,0) =3,6.

Определение антигенного действия:

Состав реакционной смеси:

1 часть антисыворотки
1 часть антигена (начиная с разведения 1:8, f = 2)
1 часть разведенного комплемента (95% ТГ; количество комплемента, равное ФПК для соответствующего разведения АГ)
Инкубация 18 часов, 4°С
2 части гемолитической системы
Инкубация 45 минут, 37 °С

Визуальная оценка результатов:

1—4-кратный положительный результат

Приготовление комплемента

Опыт 1.

Подбор ведут в присутствии 2 ЕД антигена

Состав реакционной смеси:

0,13—0,05 мл комплемента (разведение 1:20)
0,2 мл антигена
0,27—0,35 мл буфера
Инкубация 30 минут, 37 °С
0,5 мл гемолитической системы
Инкубация 30 минут, 37 °С
Визуальный учет результатов

Опыт 2.

Состав реакционной смеси:

1,0 мл разведенного комплемента (1:37,5; f = 1,25)
2,0 мл буфера
2,0 мл гемолитической системы
Инкубация 45 минут 37 °С
Фотометрическое определение 50% или соответственно 95% ТГ

Антисыворотки

Сыворотки пациентов не должны обладать гемолитической активностью, их инактивируют в течение 30 минут на водяной бане (56 °С). Последующую инактивацию проводят при той же температуре в течение 10 минут. Особое значение имеет использование точно охарактеризованных контрольных иммунных сывороток. Если это человеческие сыворотки, то они должны иметь максимально высокий титр; смесь сывороток реконвалес-центов разливают по 1 мл в ампулы и хранят при —20°С или в лиофилизированном виде. Сыворотки, хранящиеся в шкафу глубокого охлаждения в открытых сосудах, могут повреждаться углекислым газом. Многократное замораживание и оттаивание также противопоказано. Определяют наличие ком-плементингибирующей активности, стараются использовать сыворотки наиболее подходящего вида животных.

Основной опыт

Оценка результатов реакции связывания комплемента сильно зависит от того, каким образом измеряют торможение гемолиза. Фотометрическое определение степени 50% гемолиза, несмотря на точность измерения, практически не всегда удобно. Гораздо чаще используют визуальную оценку для определения 100% или 50% гемолиза. Для более точной градации можно использовать четырехбалльную шкалу. За положительный результат принимают 3—4-кратное торможение (0—50% гемолиза).

Опыт 1.

Состав реакционной смеси:

1 часть сыворотки начиная с разведения 1 :10, f=2)
1 часть антигена (2 АЕ)
1 часть комплемента (2 ФПК)
Инкубация 18 часов при 5°С и 10 минут при 37 °С
Внесение 0,5 мл гемолитической системы
Инкубация 15—30 минут при 37 °С
Визуальная оценка торможения гемолиза

Опыт 2.

Состав реакционной смеси:

1 часть сыворотки (разведения начиная с 1:10; f = 2).
1 часть разведенного антигена
0,2 мл разведенного комплемента
Инкубация 18 часов при 5°С, затем 30 минут при 37 °С
0,4 мл гемолитической системы
Инкубация 45 минут при 37 °С
Визуальная оценка торможения гемолиза

Варианты контроля

Проводят позитивный и негативный контроль антигена и сыворотки.

Контроль антигена:
0,2 мл буфера
0,2 мл разведенного антигена
0,2 мл разведенного комплемента

Контроль сыворотки:
0,2 мл буфера
0,2 мл разведенной сыворотки
0,2 мл разведенного комплемента

Микрометод

Любой вариант реакции связывания комплемента можно осуществлять в микромодификации. Необходимым в данном случае является подбор оптимальных реагентов. Используемые парциальные объемы могут составлять 25 или 50 мкл. Особое внимание следует обращать на чистоту планшетов и тщательное перемешивание комплементов. Водяную баню можно заменить термостатом. Оценивается не столько число лизированных эритроцитов, сколько количество нелизированного осадка эритроцитов. 100—50% лизис осадков рассматривается как отрицательный результат.

Положительными результатами считаются следующие:

+ + + осадок эритроцитов почти неизмененной величины сослегка окрашенной надосадочной фазой;
+ + + + осадок эритроцитов максимального размера, гемолиз отсутствует.

Для предотвращения влияния субъективных оценок результаты должны оцениваться одним и тем же исследователем. Определенные проблемы создает соотнесение предварительного и основного опытов. Трудности возникают, когда титр гемолиза в обоих опытах различается, например 50 и 100%. Это связано с тем, что 100% гемолиз установить сложнее, чем 50%. Фотометрия, особенно с применением логарифмической бумаги, позволяет преодолеть эти сложности. Их легко избежать, если пользоваться одинаковой методикой в предварительном и основном опытах. Многообразия единиц антигена и комплемента можно не опасаться, если исходить не из принципа чистоты компонентов, а из принципа оптимальной, т. е. относящейся к области эквивалентности, дозы.

Определение титра 50% гемолиза

Определение титра 50% гемолиза

По ординате — степень гемолиза,
по абсциссе: внизу — номера пробирок, вверху — титр сыворотки.