Главная


советники форекс скачать бесплатно

Фрагментация секреторного IgA

Секреторный IgA с константой седиментации 11S представляет собой димер; он состоит из четырех α-цепей и четырех легких цепей. Кроме того, он содержит секреторный компонент (СК) и J-цепь (англ. Joining peptide — соединяющий пептид). J-цепь найдена в полимерных иммуноглобулинах, содержащихся как в секретах, так и в сыворотке.

Выделение J-цепи

Материалы и оборудование. Для работы необходимо иметь человеческий S-IgA, меркаптоэтанол, йодацетамид, трис-HCl, триметиламин или Na2S03, CUSO4, NH4Cl / NH3, гуанидин-гидрохлорид, мочевину, NaCl, 0,01 М фосфатный буфер с рН 9, сефадекс G-200, ДЭАЭ-сефадекс А-50, хроматографическиеколонки 2,5х 100 см и 1,5x30 см.

Методика. Секреторный IgA человека расщепляют 0,2 М меркаптоэтанолом с последующим алкилированием. При гель-фильтрации на сефадексе G-200 в 5 М гуанидин-гидрохлориде или на сефадексе G-100 в 1 М уксусной кислоте образуются два основных пика. Первый пик содержит два компонента с отн. мол. массами 75 000 и 64 000 (в соотношении 1:4). Компонент с отн. мол. массой 75 000 является секреторным, с отн. мол. массой 64 000— а-цепью. Второй пик содержит легкие цепи и J-цепи. J- и L-цепи разделяют ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А-50, уравновешенном 0,01 М фосфатным буфером с рН 9,0, содержащим 8 М мочевину. Элюирование ведут линейным градиентом: тот же буфер, но содержащий 0,7 М NaCl.

Обсуждение. Для выделения J-цепей из полимерного сывороточного IgA или IgM достаточно обработать их 0,1 М меркаптоэтанолом; для выделения S-IgA достаточна 0,2 М концентрация меркапто-этанола. J- и L-цепи полностью отделяются друг от друга методом окислительного сульфитолиза. После восстановления меркаптоэтанолом и алкилирования J-цепь содержит примесь L-цепей. Первые могут быть выделены после сульфитолиза, минуя стадию разделения на сефадексе G-200 в 5 М гуанидин-гидрохлориде, методом хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе. Элюцию при этом проводят градиентом молярности NaCl от 0 до 0,7 М в 0,01 М фосфатном буфере с рН 9,0, содержащем 8 М мочевину. Секреторный компонент, легкие и тяжелые цепи элюируются в одной и той же фракции (см. рисунок).

Выделение J-цепи по методу ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 S-сульфонированного секреторного IgA

Выделение J-цепи по методу ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 S-сульфонированного секреторного IgA

После расщепления дисульфидных мостиков J-цепь более не связывается ковалентно с Ig и очень легко, без применения денатурирующих агентов (гуанидин-гидрохлорид, мочевина),отделяется при гель-фильтрации на сефадексе G-200 и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. J-цепь можно выделить методом диск-электрофореза в 10 М мочевине, она обладает большей электрофоретической подвижностью, особенно после окислительного сульфитолиза,. чем L-цепи, J-цепь секреторного IgA кролика после восстановления и алкилирования также может быть выделена электрофоретически в 10 М мочевине. Разделение J- и L-цепей при помощи диск-электрофореза возможно и без мочевины, а также методом иммуноадсорбции.

Простой способ разделения J- и L-цепей основан на диализе против дистиллированной воды. J-цепи выпадают в осадок, в растворе остаются J-цепи и небольшое количество L-цепей. Именно такой процедурой были получены J-цепи IgA, S-IgA и IgM человека после восстановления и гель-фильтрации в 4 М гуанидин-гидрохлориде. J-цепи секреторных IgA и IgM неразличаются в иммуноэлектрофорезе и имеют одинаковый аминокислотный состав.

Выделение секреторного компонента

Материалы и оборудование. Для работы необходимы фракция, содержащая тяжелые цепи и секреторный компонент, получаемая гель-фильтрацией продуктов окислительного сульфитолиза S-IgA человека, гуанидин-гидрохлорид; хроматографическая колонка длиной 100 см.

Методика. Исходный материал содержит секреторный компонент и тяжелые цепи. Секреторный компонент отделяется от Н-цепей при циклической рехроматографии на сефадексе G-200 в 5 М гуанидин-гидрохлориде. Вначале элюируются агрегаты тяжелых цепей, следом секреторный компонент, а затем тяжелые цепи. Степень чистоты препарата оценивают с помощью электрофореза.

Обсуждение. Секреторный компонент можно выделить комбинацией методов гель-фильтрации и иммуноадсорбции после восстановления мекраптоэтанолом и последующего алкилирования. Разделение проводят на сефадексе G-200 (колонка 2,4х150 см) в трис-HCl-буфере (рН 8,0) с 1 М NaCl. Третий пик содержит большую часть секреторного компонента. Для дальнейшей очистки 3-й пик концентрируют и хроматографируют еще раз на сефадексе G-200 для удаления остатков α- и L-цепей, затем проводят иммуноадсорбцию седиментационным методом с иммобилизованной антисывороткой кролика к миеломному IgA. Поскольку секреторный компонент не содержит метионина, он не подвергается расщеплению бромцианом, на этом свойстве основана его очистка. В секретах содержится также не связанный с IgA секреторный компонент, который может быть выделен, например, из молозива (см. рисунок).

Очистка свободного секреторного компонента

Очистка свободного секреторного компонента

Относительная молекулярная масса свободного и связанного секреторного компонента одинакова, по данным разных авторов она колеблется от 58 000 до 97 000. Секреторный компонент (СК) соединен с S-IgA в основном дисульфидными связями, однако часть молекул СК связана нековалентно. При гель-фильтрации S-IgA на сефадексе G-200 в 5 М гуанидин-гидрохлориде наблюдается диссоциация нековалентных связей, что позволяет выделить СК, хотя и не в совершенно чистом виде. Секреторный компонент кролика в отличие от человеческого СК соединяется с S-IgA только нековалентными связями. Его можно выделить гель-фильтрацией на сефадексе G-200 в присутствии 5 М гуанидин-гидрохлорида, однако получаемый препарат содержит примесь L-цепей.