Главная


Стилист казань

Двойная радиальная иммунодиффузия

В слое агара равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга делают лунки для антигена или антисыворотки. После внесения растворов в лунку эти компоненты начинают диффундировать радиально в гель. Встречаясь друг с другом, антигены и антитела начинают образовывать иммунные комплексы, которые преципитируют в ячейках геля и становятся видимыми как линии преципитации. Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод).

Материалы и оборудование. Для работы необходимо иметь моно- и полиспецифические сыворотки, чистый агар (специальный агар Noble или очищенный агар Difko, США), который можно заменить агарозой. В качестве растворителей для агара используются самые разнообразные растворы, мы приводим состав трех из них:

— 0,15 М NaCl;

— забуференный раствор NaCl с рН 7,2, состоящий из 9 частей 0,15 М NaCl и 1 части 0,07 М фосфатного буфера по Серенсену. Состав фосфатного буфера: КН2Р04— 9,073 г/л; Na2HP04*2H20— 11,87 г/л; раствор КН2Р04 в количестве 29,6 мл доводят раствором Na2HP04 до 100 мл. В результате получается 0,07 М фосфатный буфер с рН 7,2;

— натрий-ацетат — натрий-диэтилбарбитуратный буфер с рН 8,6 и ионной силой 0,1 (веронал-ацетатный буфер по Backhausz) Na-диэтилбарбитурат — 9,75 г; Na-ацетат — 6,47 г; 0,1 М HCl — 60 мл; дистиллированная вода до 1000 мл.

Приготовление геля и проведение иммунодиффузии

Расплавляют 1,5 г агара в 100 мл буфера (одного из трех предложенных) на водяной бане. Порциями по 3 мл горячий агаровый золь наносят на строго горизонтально установленные предметные стекла, для того чтобы получить равномерный слой агара толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. Рекомендуется сначала наносить на стекла по 1 мл горячего золя агарозы (10 г/л), который затем высушивают при 70 °С. Образующаяся при высушивании пленка агара усиливает сцепление геля с поверхностью стекла. В зависимости от характера иммунохимических исследований в агаре делают лунки для антигена или антитела при помощи готовых штампов или вырезают их стеклянной (можно металлической) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 4 мм, расстояние более 10 мм употребляется редко. На рисунке схематично представлены возможные варианты расположения лунок в слое геля.

Двойная радиальная иммунодиффузия: возможные варианты расположения резервуаров для растворов антигена (заштрихованы) и сыворотки (черные)

Двойная радиальная иммунодиффузия

После внесения растворов иммунодиффузию проводят во влажной камере при температуре 4°, 20° или 37 °С. Продолжительность диффузии зависит от целей исследования, она должна быть не менее 24 ч и в некоторых случаях может достигать 6—7 дней. Более продолжительная инкубация не приводит к изменениям преципитатов. В случае продолжительной иммунодиффузии пластины следует ежедневно контролировать. По окончании иммунодиффузии можно либо непосредственно оценивать результаты по влажному препарату, либо сначала отмыть непреципитирующие субстанции. Для этого замачивают пластины 2—3 раза на 12 ч в 0,15 М растворе NaCl. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при 40—50 °С или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окрашивают обычно амидочерным 10 В, после чего оценивают результаты иммунодиффузии.

Оценки результатов

Количество линий преципитации. Во множественных системах всегда существует вероятность того, что два или более комплекса антиген-антитело вследствие одинаковой скорости диффузии будут образовываться в одном и том же участке геля, формируя, следовательно, одну линию преципитации. Кроме того, концентрация антител и антигенов или соотношение компонентов реакции может быть настолько неблагоприятным, что видимые преципитаты не будут образовываться. Поэтому число видимых линий преципитацпи, как правило, меньше числа систем антиген-антитело или в лучшем случае равно ему.

Расположение преципитатов между лунками. При оптимальном соотношении между антигенами и антителами после окончания диффузии линия преципитации располагается примерно на середине расстояния между лунками. Если один из компонентов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим содержанием реагента. Если соотношение концентраций реагентов может измениться в месте первичного выпадения предметов, например, вследствие избыточного поступления одного из компонентов, это приводит к смещению линии преципитации. Часть иммунных агрегатов, особенно в зоне избытка антител, может оставаться на старом месте в виде вуали и расширения линии преципитации. Именно возможность возникновения таких процессов обусловливает необходимость ежедневных проверок пластин геля при длительно протекающей иммунодиффузии. Взаимное расположение линий (сравнительный анализ). Для выявления полной или частичной идентичности обычно располагают лунки в углах треугольника, в две помещают растворы сравниваемых антигенов, в третью — антисыворотку. Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации:

1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов.

2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с антисывороткой детерминанты антигены неидентичны и, следовательно, сами антигены различны.

3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой "шпоры". "Шпора" часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с антигенами сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими антителами иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из антигенов имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих антител в антисыворотке приводит к образованию "шпоры".

4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это означает, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической антисыворотки.

Основные типы преципитации представлены на рисунке:

Расположение линий преципитации при сравнительных исследованиях методом двойной радиальной иммунодиффузии

Расположение линий преципитации при сравнительных исследованиях методом двойной радиальной иммунодиффузии

а — 1—4 варианты преципитации; б — анализ органоспецифических антигенов. В центре— антисыворотка к экстракту почек (АСЭП): ЭП — экстракт почек; СЧ— сыворотка человека. В сыворотке человека и в экстракте почек присутствует один общий антиген (идентичная реакция). Второй антиген присутствует только в экстракте почек (перекрестная реакция с первым аг) (препарат проф. Friemel)»

Модификация метода

Вышеописанная методика иммунодиффузии на предметных стеклах представляет собой микровариант метода, предложенного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2—3 мм, лунки и соответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодвинуты друг от друга на значительные расстояния, линии преципитации длинные и хорошо выраженные.

Титрование. Для титрования растворов антигенов или антисывороток располагают лунки так, как показано на рисунке:

Двойная радиальная иммунодиффузия. Титрование раствора антигена (титр 1 : 16)

Двойная радиальная иммунодиффузия. Титрование раствора антигена

Одинаковые объемы растворов антигена, приготовленных двукратным разведением, вносят в периферические лунки. Такой же объем антисыворотки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиффузии учитывают:

1. Расстояние от линии преципитации до центральной и периферической лунок.

2. Наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата.

3. Интенсивность и ширину полос преципитации. Наибольшее разведение, при котором еще образуются видимые преципитаты, дает значение титра. Этим способом можно также определять количество преципитирующих антител в различных антисыворотках, которые, например, можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором антигенов.

Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного определения антигена. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентрация антигена, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнения со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена в исследуемой пробе.

Оценка метода

Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации. Титрование и полуколичествеиное определение антигенов расширяет возможности применения метода. Определение отдельных антигенов в многокомпонентных растворах требует применения моноспецифических антисывороток. Метод двойной радиальной иммунодиффузии можно использовать также для анализа трудно-растворимых субстанций, таких, как кератин и прокератин, с условием предварительной их солюбилизации ДСН, гуанидин-хлоридом (до 6 М), мочевиной (до 8 М). После солюбилизации эти вещества продолжают реагировать с соответствующими антителами в геле агарозы.