Главная


очень сильный приворот на любовь

Получение тканевых экстрактов. Методика

Исходным материалом для получения антигенов, ассоциированных с опухолями (ААО), служила опухолевая ткань с гистологическим подтверждением; участки некроза и нормальную ткань предварительно удаляли. Антигены нормальной ткани (АНТ) получали из секционного материала, взятого через 8 часов после смерти. Антигены эмбриональной ткани (АЭТ) получали из абортного материала или из эмбрионов животных, например мышей. Все образцы тканей сохраняли без потери активности при — 25 °С в течение многих месяцев. Принципиальная схема получения антигенов ассоциированных с опухолями и антигенов нормальной ткани представлена на рисунке:

Получение антигенов нормальной ткани (АНТ), антигенов эмбриональной ткани (АЭТ) и антигенов, ассоциированных с опухолями (ААО), по методу экстракции с 3 MKCI.

Получение антигенов нормальной ткани (АНТ), антигенов эмбриональной ткани (АЭТ) и антигенов, ассоциированных с опухолями (ААО), по методу экстракции с 3 MKCI

 

Грубое измельчение ткани, желательно в полузамороженном состоянии, проводят при помощи ножниц (оптимальный размер кусочков ткани составляет менее 5 мм в диаметре). Затем кусочки ткани гомогенизируют, например, в гомогенизаторе с ножами (Biihler, Ttibingen, 13000 об/мин). Разрушение ведут небольшими порциями, следя, чтобы температура гомогената не поднималась выше 10 °С, длительность каждого разрушения не должна превышать 1—2 мин.

После центрифугирования проводят диализ надосадочной фракции и концентрируют ее против полиэтиленгликоля 20000 до 1/5-1/10-ю исходного объема. Выпадающие в осадок белки удаляют центрифугированием. Проводят осаждение, добавляя равный объем насыщенного раствора сульфата аммония в 0,15 М фосфатном буфере с рН 7,2. После перемешивания растворов смесь оставляют при 4°С на 12 часов для достижения полноты осаждения. Осадок собирают центрифугированием, растворяют в ФСБ с рН 7,2 и диализуют против ФСБ. Как правило, раствор не является достаточно прозрачным и перед разделением на колонках его еще раз центрифугируют. Гель-фильтрацию проводят на сефадексе G-200 или на ультрагеле АсА 34.

Размер колонки зависит от количества разделяемого материала (например, 32X1200 мм). Элюцию проводят ФСБ или 0,01 М трис-HCl-буфером с рН 7,3, содержащим 0,85% NaCl. Регистрируют оптическую плотность элюируемых фракций на волне 280 нм (Увикорд II, Швеция), разделение проводят при 4°С. На рис. 139 и 140 изображены профили элюции различных ААО, АНТ и АЭТ мыши и человека, полученных в одинаковых условиях фракционирования. Изменения оптической плотности элюируемого материала в УФ области дают мало ценной информации, поскольку они в основном обусловлены сопутствующими белками. Объединенные фракции PI, Р2 и РЗ концентрировали методом диафильтрации (установка фирмы Amicon, Нидерланды) до концентрации белка 1—1,5% и сохраняли их при —25 °С в течение нескольких месяцев без потери активности. Выход антигенов зависит от типа ткани. В среднем, например, фракция Р2 содержала 0,2—0,8% белка от веса влажной ткани. При работе более чем с 50 г ткани, выход снижался. Данные об антигенном составе различных фракций, приводимые в литературе, существенно различаются между собой, что, вероятно, связано с использованием различных методов оценки.

Наши собственные исследования сенсибилизированных лимфоцитов в реакции электрофоретической подвижности (РЭФП) и в реакции торможения адгезии (РТАЛ) представлены на рисунках, а также в таблице:

Система мышиных клеток

Система мышиных клеток

 Разделение АНТ, АЭТ и ААО на ультрагеле Аса 34; изучение антигенности отдельных фракций на лимфоцитах соответствующих и несоответствующих доноров. 1 — NTA СВА (Н-2К), лимфоциты С57В1/6 (Н-2), аллогенная сенсибилизация против СВА, тест электрофоретической мобильности (ЭМ); 2 — FA СВА, лимфоциты мышей BIOD2 XCBAd и СВА с опухолью BP, тест ЭМ; 3 — ААО BP, лимфоциты мышей с опухолью BP/CBA, MC/CBA, тест ЭМ; 4 —ААО BP (см. 3), реакция торможения адгезии лимфоцитов.

Система клеток человека

Система клеток человека

Разделение АНТ и ААО на сефадексе G-200. Исследование антигенности отдельных фракции на лимфоцитах соответствующих и несоответствующих доноров. 1 — АНТ из почек, лимфоциты больного с гломерулонефритом (аутосеисибилизация к АГ почек); 2 — ААО карциномы бронхов, лимфоциты больного с карциномой бронхов и больного с остеосаркомой, тест ЗМ; 3 — ААО карциномы кишечника, лимфоциты больного с карциномой кишечника и карциномой желудка, тест ЭМ.

В области Р2 методом РЭПФ в случае АНТ и АЭТ выявляются антигены, относящиеся к области гистосовместимости (тканевой специфичности); в случае ААО — индивидуальные антигены (мышь) или относящиеся к области гистоспецифичности и органоспецифичности. Белки из области РЗ, относящиеся к ААО и АЭТ, в РЭПФ проявляют опухолеспецифичные свойства. В области Р1 в РЭПФ до настоящего времени были исследованы экстракты некоторых опухолей желудочно-кишечного тракта человека, все они обладают общей опухолевой специфичностью. Исследование соответствующих фракций методом РТАЛ дает следующую картину: Н-активность в случае АНТ или индивидуальные ААО-активности обнаруживаются в области Р2 или Р1, в то время как перекрестные реакции, по всей видимости, полностью отсутствуют (не определяется активность в области РЗ). Равнозначность распределения активности в мышиных и человеческих системах, позволяет предположить существование общих закономерностей. При помощи вышеописанного метода экстракции в случае АНТ и АЭТ в области Р2 была выявлена активность, относящаяся к МНС-комплексу.

То же самое сохраняет справедливость для ААО, если исходить из предположения о том, что опухолеспецифические антигены детерминанты имеют отношение к МНС-комплексу или являются модифицированными антигенами гистосовместимости. Выраженная перекрестная реактивность АЭТ и ААО в областях Р1 и РЗ (преимущественно в РЭПФ) остается до настоящего времени без объяснения. Феномен может быть связан с наличием общих опухолевых антигенов (онкофетальные, вирусные) или с артефактами при получении препаратов.

Наши данные совпадают с результатами, согласно которым опухолеспецифические трансплантационные антигены растворимой мембранной фракции после гель-хроматографии обнаруживаются в области с отн. мол. массами 70000—150000. Методом РТАЛ опухолеспефицические антигены также определяются в области отн. мол, масс 70000—150000.

Антигенность и специфичность полученных при помощи 3 МKCI экстрактов ААО, АНТ и АЭТ в РЭФП и РТАЛ

Антигенность и специфичность